1. 多環芳烴()的測定
85.2.4.1 苯並［a］芘的高效液相色譜法測定
方法提要
利用索氏提取原理，採用正己烷-丙酮(1+1)混合溶劑提取土壤中苯並［a］芘，提取液經硅膠柱凈化、濃縮、定容後，高效液相色譜-紫外-熒光檢測器串聯檢測，外標法定量。
方法適用於土壤、沉積物、固體廢棄物等固體試樣中苯並［a］芘的分析。取樣量為10g時，方法檢出限為0.60ng/g。
試樣中共存色素、類酯化合物和其他性質相似污染物會干擾測定，需凈化後測定。苯並［a］芘見光易分解，制樣和測定時應盡可能避光操作。
儀器與裝置
高效液相色譜儀帶紫外檢測器、熒光檢測器。
旋轉蒸發儀。
恆溫水浴氮吹儀。
振盪器。
索氏抽提器。
固相萃取凈化硅膠柱(1g，6mL)。
分析柱WastersPAHsC18液相色譜專用柱，250mm×4.6mm，粒徑5μm;或C18液相色譜柱，250mm×4.6mm，粒徑5μm。
試劑與材料
無水硫酸鈉、氯化鈉優級純，在600℃高溫爐中灼燒4h放置在乾燥器中備用。
正己烷、丙酮等均為農殘級。
甲醇HPLC級。
替代物標准p-三聯苯稱取固體三聯苯替代物標准，以甲醇溶液溶解、定容，並用甲醇逐級稀釋為10.0μg/mL儲備液，-18℃下保存備用。
替代物標准1-氟萘100.0μg/mL有證標准物質。
標准儲備溶液苯並［a］芘，-18℃下避光保存，購自國家標准物質中心。
銅粉和銅片使用前活化，活化方法參見85.2.2.1試劑與材料部分。
針頭過濾器及注射器針頭過濾器型號孔徑0.45μm，直徑4mm，聚四氟乙烯濾膜。
樣品採集與保存
土壤樣品採集時需要將已風化的表層土壤拔開，用金屬采樣鏟將土壤樣品裝於250mL棕色廣口瓶中，立刻貼上標簽，標明有關信息，盡快送實驗室檢測。
潮濕土壤樣品需要冷凍乾燥，以除去其中水分。若無冷凍乾燥設備可將土壤避光自然陰干，時間不宜過長，一般2～3d即可。土壤樣品風干後進行粉碎，土壤顆粒達到40目以上即可進行分析。也可以不經乾燥直接測定，但取樣時同時進行含水量的測定，檢測結果以干基報出。土壤樣品保存在陰涼處，提取液40d內完成檢測。
苯並(a)芘對光敏感。在樣品採集、運輸、儲存以及分析全過程應盡可能避光操作，防止光解。
分析步驟
1)試樣提取。稱取10.00g土壤試樣品及5g無水Na2SO4於100mL燒杯中，用玻璃棒將Na2SO4與土壤試樣混勻後置於濾紙筒中，加入10.0μg/mL的三聯苯和1-氟萘替代物標准溶液各10μL。濾紙筒轉入索式提取器，添加70mL正己烷-丙酮(1+1)混合提取液，其中20mL浸泡試樣。浸泡12h後，試樣在75℃恆溫水浴上提取24h。為了減少單質硫對檢測的干擾，可將2～5粒銅片或0.5g銅粉與土壤試樣混勻後抽提。提取液KD濃縮至5～10mL，氮氣吹掃濃縮至2～3mL，待凈化。
2)試樣凈化。凈化硅膠柱預先用10mL10%丙酮-正己烷溶液、10mL正己烷活化後，待正己烷接近硅膠頂層時迅速將待凈化樣品提取液轉入柱中，先用5mL正己烷淋洗，棄之，再用25mL正己烷-二氯甲烷(1+1)混合溶液淋洗，淋洗液用KD濃縮瓶承接，氮氣濃縮，甲醇換相、最後定容至1.0mL，0.45μm有機濾膜過濾HPLC測定。
3)校準曲線。用甲醇分別稀釋1.93μg/mL苯並［a］芘二級標准溶液，配製成0ng/mL、1.93ng/mL、9.65ng/mL、19.3ng/mL、28.9ng/mL、38.6ng/mL標准系列，每個標准系列點加入10μL的10.0μg/mL三聯苯、1-氟萘替代物標准溶液。通過濃度與對應峰面積建立標准曲線。
4)高效液相色譜分析條件。流動相為甲醇溶液，流速1.2mL/min(恆流方式)，柱溫40℃。紫外檢測器(UV)，波長254nm。熒光檢測器(FLD)，0～6min，激發波長(Ex)250nm，發射波長(Em)370nm;6～15min，激發波長294nm，發射波長430nm。
5)定性及定量分析。
a.定性分析。採用試樣中待測目標物保留時間與標准目標物保留時間相比較的方式進行定性分析。檢測方法採用熒光和紫外串聯檢測的方式。特別當有干擾存在時，應仔細分析熒光和紫外色譜圖排除干擾。如果試樣中待測目標物含量達到方法檢出限5倍以上，需GC-MS確證。
b.定量分析。採用熒光和紫外串聯檢測的方式進行定量分析。以熒光檢測定量為主，對有干擾存在應結合紫外檢測情況綜合確定。外標法定量。再根據試樣測定濃度、稱樣量計算出試樣中濃度。目標化合物峰面積和定量校準曲線可以由高效液相色譜儀工作站自動完成，定量校準曲線也可由EXCEL工作軟體完成。對自動積分的峰面積應逐一檢查各峰基線，對不合理基線進行必要修正。
岩石礦物分析第四分冊資源與環境調查分析技術
對含量接近檢出限水平的試樣，可以採用與其濃度相近的標准單點校正。對於含量超過校準曲線上限的試樣應稀釋或減小取樣量，使其峰面積保持在校準曲線的線性范圍內，重新測定。
6)方法檢出限。將質量為19.3ng的苯並［a］芘標准分別加入到空白土壤試樣中，餘下同試樣分析，以3倍信噪比對應濃度作為方法檢出限。取樣10g時，方法檢出限為0.60ng/g.。
7)質量控制。參考82.16.1苯並(a)芘的高效液相色譜法測定。
注意事項
參考82.16.1苯並(a)芘的高效液相色譜法測定。
85.2.4.2 土壤樣品中16種多環芳烴的高效液相色譜法測定
方法提要
利用索氏抽提原理，採用二氯甲烷-丙酮(3+1)混合溶劑提取土壤試樣中萘、苊、二氫苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯並［a］蒽、、苯並［b］熒蒽、苯並［k］熒蒽、苯並［a］芘、茚並［1.2.3-Cd］芘、二苯並［a.h］蒽、苯並［g.h.i］苝16種特定多環芳烴提取出來，提取液經凈化(硅膠柱或GPC)、濃縮後，高效液相色譜-熒光-紫外檢測器串聯檢測，外標法定量。
方法適用於土壤、沉積物、固體廢棄物等試樣中萘、苊、二氫苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯並［a］蒽、、苯並［b］熒蒽、苯並［k］熒蒽、苯並［a］芘、茚並［1.2.3-Cd］芘、二苯並［a.h］蒽、苯並［g.h.i］苝16種特定多環芳烴分析。
方法檢出限與儀器靈敏度和樣品基質有關，當取樣量為10.0g時，本方法檢出限在1.00～10.00ng/g之間。
儀器與裝置
高效液相色譜儀熒光檢測器和紫外檢測器。
旋轉蒸發儀。
氮吹儀。
振盪器。
硅膠層析凈化柱(30cm×1.0cm)凈化前加入6.0g活化好的硅膠，干法裝柱或將6.0g硅膠放入20mL正己烷中濕法裝柱。
分析柱德國Waters公司WatersPAHsC18或SupelcosilLC-PAH液相色譜專用柱，規格250mm×4.6mm，粒徑5μm。
凝膠滲透色譜儀(GPC)帶PhenomenexEnvirosepABCsize350×21.20mm0micron凈化柱。
索氏抽提器帶150mL平底燒瓶。
試劑
乙腈PLC級。
二氯甲烷、正己烷農殘級。
無水硫酸鈉、氯化鈉在600℃高溫爐中灼燒4h，冷卻後存放在乾燥器中備用。
替代物標准p-三聯苯稱取固體三聯苯替代物標准，以甲醇溶液溶解、定容，並用甲醇逐級稀釋為10.0μg/mL替代物儲備液。替代物標准1-氟萘，直接購買有證標准物質。替代物標准物質均在-18℃下保存備用。將替代物標准添加到每個試樣、標准和空白中，檢驗萃取、富集、凈化和儀器分析過程中污染、損失、儀器分析誤差以及樣品基體對分析結果的影響。
標准儲備溶液16種TCLPAHSMix標准溶液，萘、苊、二氫苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯並［a］蒽、、苯並［b］熒蒽、苯並［k］熒蒽、苯並［a］芘、茚並［1.2.3-Cd］芘、二苯並［a.h］蒽、苯並［g.h.i］苝等，濃度各2000μg/mL。
硅膠80～120目500℃高溫爐中烘5h，冷卻後存放在乾燥器中備用。使用前在一個淺盤中於130℃活化至少8h，用金屬鋁箔輕輕覆蓋，冷卻後存放在乾燥器中備用。
銅粉和銅片使用前活化，活化方法參見85.2.2.1試劑與材料部分。
針頭過濾器及注射器針頭過濾器型號孔徑0.45μm，直徑4mm，聚四氟乙烯濾膜。
分析步驟
1)土壤樣品的預處理。試樣提取:
准確稱取10.00g土壤試樣、10.0g無水硫酸鈉於同一燒杯中，加入10μg/mL的1-氟萘替代物標准6μL、1.0g銅粉或銅片，攪拌均勻，無損移入濾紙筒內，上部蓋一片濾紙，將濾紙筒裝入索氏提取器中。在平底燒瓶中加入80mL二氯甲烷-丙酮(3+1)混合溶劑，其中20mL浸泡試樣。浸泡12h後，在60℃恆溫水浴上加熱提取24h。如果採用方法1硅膠層析柱凈化，待提取液冷卻後，加入3mL正己烷，KD濃縮至2～3mL，再加入3mL正己烷，最後濃縮到2～3mL，接試樣凈化方法1。當採用GPC凈化時二氯甲烷濾液旋轉蒸發至5mL，再轉移至5mL比色管定容至3.00mL，接方法2GPC凈化。樣品凈化一般污染樣品凈化選擇硅膠層析柱凈化方法，色素、脂類污染較重選擇GPC凈化。
方法1硅膠層析柱凈化。將10mL二氯甲烷-正己烷(2+3)混合試劑和20mL正己烷通過硅膠層析凈化柱(規格30cm×1.0cm)，待正己烷快要流完時，用5mL正己烷將待凈化試液轉移至柱上。在硫酸鈉層快要露出空氣之前，加25mL正己烷淋洗硅膠柱，棄去流出液。然後用25mL二氯甲烷-正己烷(2+3)淋洗硅膠柱，收集淋洗液在30mLKD濃縮瓶中，加1mL乙腈，氮氣吹至0.5mL，再加2mL乙腈，再次氮氣吹到0.5mL，最後乙腈定容至1.0mL，0.45μm濾膜過濾，HPLC檢測。
方法2GPC凈化。待凈化試液定容至3.0mL，取2.5mL上×21.20mm凈化柱。GPC的流動相為二氯甲烷，定量環為2mL，紫外檢測器。清洗15min後上樣，流速為5mL/min，柱溫24℃，收集所需餾分時間為18～26min，排出廢液時間為5min。收集的餾分加入1mL乙腈，旋轉蒸發至約為5mL，氮氣吹到0.5mL，再加入2mL乙腈，氮氣吹到0.5mL，最後乙腈定容至1.0mL，0.45μm有機相濾膜過濾，HPLC檢測。
2)校準曲線。配製0.00ng/mL、5.00ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL、80.0ng/mL標准溶液系列，各標准點加入10.0μg/mL1-氟萘、三聯苯替代物各6μL。通過濃度與對應峰面積建立標准曲線。
3)高效液相色譜分析條件。A泵乙腈;B泵水;柱溫30℃;流速1.5mL/min;進樣量20μL;梯度洗脫，洗脫程序見表85.21。紫外波長，280nm;熒光檢測器激發、發射波長見表85.22。
表85.21 梯度洗脫程序
表85.22 熒光檢測器激發、發射波長
續表
4)色譜圖。
圖85.7 Waters PAHC18柱熒光檢測多環芳烴液相色譜圖
5)定性及定量分析。
a.定性分析。採用與標准目標物保留時間相比較的方式對試樣待測目標物進行定性分析。對有干擾存在或試樣待測目標物含量達到方法檢出限5倍以上的組分，需要進行氣相色譜-質譜確證或其他方法確證。
b.定量分析。採用熒光和紫外串聯檢測的方式進行定量分析。以熒光檢測定量為主，對有干擾存在的目標物應結合紫外檢測情況綜合確定定量的方式。定量方法為外標法。對自動積分的峰面積應逐一檢查各峰基線，對不合理基線進行必要修正。
根據試樣目標物測定濃度、萃取液定容體積和稱樣量計算出樣品中目標化合物濃度。
岩石礦物分析第四分冊資源與環境調查分析技術
由5個濃度水平建立的校準曲線的線性相關系數必須滿足R2≥0.995以上。對含量接近檢出限水平的試樣，可以採用與其濃度相近的標准單點校準。對於含量超過校準曲線上限的試樣應減小取樣量，重新測定，使其峰面積保持在校準曲線的線性范圍內。
6)方法性能指標。儀器的精密度、檢出限、加標回收:以10ng/mL16種PAHS混合標准溶液平行測定10次，計算相對標准偏差RSD。以3倍於雜訊的信號對應濃度作為儀器檢出限。參見82.16.26)方法性能指標。
將質量為30.00ng的16PAHs種混合標准和60ng1-氟萘替代物標准加入到土壤試樣中，按試樣分析步驟進行分析，基體加標回收率在76.4%～111%，替代物1-氟萘回收率為83.7%～103%。
熒光檢測器的線性范圍小於紫外檢測器線性范圍，特別是苯並［k］熒蒽由於有非常高的響應值，線性范圍較窄，可以通過稀釋或減小進樣量使分析濃度保持在線性范圍內。
85.2.4.3 16種多環芳烴的氣相色譜-質譜法(GC-MS)測定
方法提要
多環芳烴在二氯甲烷、正己烷和丙酮等有機溶劑中有較大溶解度，採用二氯甲烷-丙酮(2+1)混合溶劑提取土壤樣品中的16種特定多環芳烴，提取液經硅膠層析柱或凝膠滲透色譜凈化、濃縮、定容後GC-MS選擇離子檢測。
方法適用於土壤、沉積物等樣品。方法檢出限與儀器靈敏度和樣品基質等條件有關，當取樣量為10.0g時，本方法檢出限在2.0ng/g。
干擾情況同85.2.4.2。
儀器與裝置
氣相色譜-質譜聯用儀EI源，帶自動進樣器。
凝膠滲透色譜儀(GPC)美國OI公司。帶PhenomenexEnvirosepABCsize350×21.20mm0micron凈化柱。
色譜柱Rtx-5Sil-MS彈性石英毛細柱30m×0.32m，0.25μm膜後或性質相似色譜柱。
硅膠層析凈化柱規格30cm×1.0cm。填6g活化後的硅膠。
旋轉蒸發器氮氣吹掃儀。
索氏抽提器帶150mL平底燒瓶。
試劑
二氯甲烷、正己烷、丙酮均為農殘級。測定前應進行空白檢驗。
無水硫酸鈉、氯化鈉分別在600℃馬弗爐中灼燒4h，冷卻後存放在乾燥器中備用。
16種多環芳烴標准溶液苊、二氫苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯並［a］蒽、、苯並［b］熒蒽、苯並［k］熒蒽、苯並［a］芘、茚並［1.2.3-cd］芘、二苯並［a.h］蒽、苯並［g.h.i］芘，各化合物濃度為2000μg/mL。
氘代標記內標化合物溶液氘代苊、氘代菲、氘代、氘代苝，各化合物濃度為500μg/mL。
替代物溶液1-氟萘，三聯苯-d14，1mg/mL甲醇溶液。-18℃溫避光保存。
硅膠80～120目500℃馬弗爐中灼燒5h，冷卻後保存在乾燥器中備用。使用前在一個淺盤中於130℃至少活化8h，冷卻後存放在乾燥器中。
銅粉或銅片使用前活化，活化方法參見85.2.2.1試劑與材料部分。
樣品採集與保存
參見85.2.4.1的採集與保存部分。
分析步驟
1)提取。同85.2.4.2，其中原方法中替代物標准p-三聯苯改為三聯苯-d14，替代物標准加標量為50ng。
2)凈化。
方法1硅膠層析柱凈化。土壤樣品提取液經濃縮後完全轉移到事先已分別用10mL二氯甲烷-正己烷、25mL正己烷淋洗過硅膠層析柱上，再用2mL正己烷來定量完全樣品轉移。在硫酸鈉層剛剛露出空氣之前，加25mL正己烷淋洗硅膠柱，棄之流出液。然後用25mL二氯甲烷-正己烷(1∶1，V∶V)淋洗硅膠柱，淋洗液收集在30mLKD濃縮瓶中，N2吹至0.5mL，加正己烷2mL，N2再次吹至1mL，加入10μg/mL內標氘代苊、氘代、氘代菲和氘代苝6μL，最後定容至1.0mL，GC-MS測定。
方法2GPC凈化。凈化方法基本同85.2.4.2實驗方法。只是收集的PAHs餾分試液換相成正己烷相，定容前加入內標氘代苊、氘代、氘代菲和氘代苝各60ng，最後定容至1.0mLGC-MS測定。
3)GC-MS分析條件。
色譜條件。進樣口溫度，290℃;不分流進樣，進樣量1μL。柱前壓12×6895Pa。升溫程序，初溫80℃，保持1min，再以10℃/min升溫至300℃，保持3min。
質譜條件。離子源溫度220℃;介面溫度，280℃;掃描范圍為50～400m/z;電離電壓，70eV。定性分析採用全掃描方式，定量分析採用選擇離子檢測SIM，各目標化合物檢測特徵質量數見表85.23。
表85.23 目標化合物檢測特徵離子
GC-MS儀器調諧。參見85.2.2.2實驗方法。
4)校準曲線。用正己烷將多環芳烴標准儲備液(2000μg/mL)逐級稀釋至10.0μg/mL，再稀釋配成0.00ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL、200ng/mL標准系列。氘代內標溶液以正己烷稀釋至10.0μg/mL。定容前將替代物標准、內標加到標准系列中，加標量與試樣同。
5)多環芳烴標准溶液的總離子流色譜圖見圖85.8所示。
圖85.8 16種多環芳烴標准溶液總離子流圖
6) 定性及定量分析。
定性分析: 參見 85.2.1 定性分析部分。
定量分析: 定量方法為內標法，參見 85.2.1 定量分析部分。。
7) 方法性能指標。取 10.0g 土壤，加入 50.0ng 替代物標准，20.0ng 16 種多環芳烴混合標准，之後與試樣預處理和分析步驟相同。測定回收率為 75.4%～96.2%。
8) 質量控制。批量樣品質量控制及過程式控制制參見 85.2.2 有機氯農葯分析方法。
2. 9.現有一超高分子量的聚乙烯試樣，欲採用GPC方法測定其分子量和分子量分布，試問： （2）常溫下能進行測定
(1) 顯然不能採用THF做溶劑，應該選用甲苯或氯仿為溶劑；
(2) 由於UHMWPE分子量過高，需要注意所用PS標樣上限分子量，可能需要在50度下進行測定，溫度升高，提高保留時間，減小測量誤差；
(3) GPC測定一般得到數均分子量，進行換算吧。
如果回答還算滿意，別忘了給分啊，呵呵。
3. GPC-MALLS原理
GPC-MALLS原理GPC上一般用的小角度激光光散射檢測器。
凝膠具有化學惰性，它不具有吸附、分配和離子交換作用。讓被測量的高聚物溶液通過一根內裝不同孔徑的色譜柱，柱中可供分子通行的路徑有粒子間的間隙（較大）和粒子內的通孔（較小）。當聚合物溶液流經色譜柱（凝膠顆粒）。
較大的分子（體積大於凝膠孔隙）被排除在粒子的小孔之外，只能從粒子間的間隙通過，速率較快；而較小的分子可以進入粒子中的小孔，通過的速率要慢得多；中等體積的分子可以滲入較大的孔隙中。
分離原理：
而較小的分子可以進入粒子中的小孔，通過的速率要慢得多；中等體積的分子可以滲入較大的孔隙中，但受到較小孔隙的排阻，介乎上述兩種情況之間。 經過一定長度的色譜柱，分子根據相對分子質量被分開，相對分子質量大的在前面（即淋洗時間短），相對分子質量小的在後面（即淋洗時間長）。
自試樣進柱到被淋洗出來，所接受到的淋出液總體積稱為該試樣的淋出體積。當儀器和實驗條件確定後，溶質的淋出體積與其分子量有關，分子量愈大，其淋出體積愈小。
4. 請說明下液相色譜的原理以及操作時候的注意點
原理：
高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，在技術上，流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達4.9´107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高於經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或幾十萬）；同時柱後連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。
特點
1．高壓：液相色譜法以液體為流動相（稱為載液），液體流經色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達150～350×105Pa。
2. 高速：流動相在柱內的流速較經典色譜快得多，一般可達1～10ml/min。高效液相色譜法所需的分析時間較之經典液相色譜法少得多，一般少於 1h 。
3. 高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。
4.高靈敏度：高效液相色譜已廣泛採用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達10-11g。另外，用樣量小，一般幾個微升。
5.適應范圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難於應用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能製成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對於高沸點、熱穩定性差、相對分子量大（大於 400 以上）的有機物（這些物質幾乎佔有機物總數的 75% ～ 80% ）原則上都可應用高效液相色譜法來進行分離、分析。 據統計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約佔20%，而能用液相色譜分析的約佔70～80%。
高效液相色譜按其固定相的性質可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、解析度高、重復性好，且須在色譜儀中進行。
高效液相色譜法的主要類型及其分離原理
根據分離機制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類型：
1 ．液 — 液分配色譜法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography)
流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從於下式：
式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm--溶質在流動相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決於K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。
a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小於固定液的極性。
b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大於固定液的極性。
c. 液 — 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見後），可克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。
2 ．液 — 固色譜法
流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：
Xm + nSa ====== Xa + nSm
式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。
當吸附競爭反應達平衡時：
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]
3 ．離子交換色譜法(Ion-exchange Chromatography)
IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。
以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：
X-(溶劑中) + (樹脂-R4N+Cl-)=== (樹脂-R4N+ X-) + Cl- (溶劑中)
當交換達平衡時：
KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]
分配系數為：
DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]
[討論：DX與保留值的關系]
凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。
4 ．離子對色譜法(Ion Pair Chromatography)
離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原理可用下式表示：
X+水相 + Y-水相 === X+Y-有機相
式中：X+水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X+Y---形成的離子對化合物。
當達平衡時：
KXY = [X+Y-]有機相/[ X+]水相[Y-]水相
根據定義，分配系數為：
DX= [X+Y-]有機相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相
[討論：DX與保留值的關系]
離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、鹼和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物鹼以及葯物等分離。
5 ．離子色譜法(Ion Chromatography)
用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。
以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）：
抑制柱上發生的反應：
R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O
R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-
可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H+Br-，可用電導法靈敏的檢測。
離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用於陽離子分析。
6 ．空間排阻色譜法(Steric Exclusion Chromatography)
空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱後，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔並滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最後出現。
高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、．分離系統、檢測系統和數據處理系統，下面將分別敘述其各自的組成與特點。
1．進樣系統
一般採用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恆定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。
2．輸液系統
該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l．47～4．4X107Pa，流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高解析度、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質（即使僅有一個基團的差別或是同分異構體）都能獲得有效分離。
3.分離系統
該系統包括色譜柱、連接管和恆溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管），內徑為2～5mm，由"優質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料製成，住內裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質和固定液構成）．固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000?）和比表面積大的特點，加之其表面經過機械塗漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學法偶聯各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）後，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、緻密狀態，極易降低渦流擴散效應。基質粒度小，微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高解析度是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小，會提高解析度的道理。
再者，高效液相色譜的恆溫器可使溫度從室溫調到60C，通過改善傳質速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。
4．檢測系統
高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。
（1）紫外檢測器
該檢測器適用於對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。其特點：使用面廣（如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測下限為10-10g／ml）；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。
（2）示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為10-7g／ml），流動相的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用於痕量分析，也不適用於梯度洗脫樣品的檢測。
（3）熒光檢測器
凡具有熒光的物質，在一定條件下，其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用於具有熒光的有機化合物（如多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限為10-12～10-14g／ml），痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可採用。
（5）數據處理系統
該系統可對測試數據進行採集、貯存、顯示、列印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。
操作注意要點：
1)． 首先對流動相進行過濾，根據需要選擇不同的濾膜，一般為有機系和水系，常用的孔徑為0.20um和0.45um。
2)． 對抽濾後的流動相進行超聲脫氣10-20分鍾。
3)． 正常情況下，儀器首先用甲醇沖洗10-20分鍾，然後再進入測試用流動相(如流動相為緩沖試劑，則要二次重蒸水沖洗10-20分鍾，直至色譜柱中有機相沖凈為止) 。
4)． 一般情況下，流動相沖洗20-30分鍾後，儀器方可穩定，最重要的是儀器基線走後，方可進樣測試。
5)． 同時進兩針標樣，將其結果相比較，其結果的比值在0.98-1.02之間後，就可以正式進行樣品的測試了。
6)． 樣品測試結束後，就要進行色譜儀及色譜柱的清洗和維護。如流動相為緩沖試劑，同樣也要用重蒸水清洗10-20分鍾，方可用有機相進行保護，否則，有損色譜柱。
7)． 關機時，先關計算機，再關液相色譜。
8)． 填寫登記本，由負責人簽字。
注意事項：
1)． 流動相均需色譜純度，水用20M的去離子水。脫氣後的流動相要小心振動盡量不引起氣泡。
2)． 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過柱子。
3)． 所有過柱子的液體均需嚴格的過濾。
4)． 壓力不能太大，最好不要超過150kgf/cm2 .
5). 因為緩沖試劑遇有機溶劑，會結晶，有損色譜柱，所以，每次由有機相變流動相或流動相變有機相均需用蒸餾水清洗。
5. 在用GPC測定聚合物相對分子質量時,為什麼要用標准樣品進行校正
用gpc測定聚合物分子量及其分布，採用什麼檢測器要求精確測定溶液濃度
凝膠滲透色譜(gpc)...分離後的高分子按分子量從大到小被連續的淋
洗出色譜柱並進入濃度檢
6. GPC測定分子量為什麼屬於間接法
GPC是通過測定已知分子量的標樣分子量與流出時間的關系，即建立起Mn與流出體積之間關系式，再通過測定待測樣的流出時間來得到待測樣的分子量。因而是間接法。
7. gpc測分子量的原理
gpc測分子量的原理：將不同分子量的聚合物分開。GPC得出的原始數據為流出時間（不同的流出時間對應的分子量不同，根據標准曲線就可以算出該流出時間下對應的分子量），以及強度（對應於該分子量聚合物占總聚合物的重量分數），這樣就可以算出該聚合物的重均分子量，根據重均分子量可以根據公式算出數均分子量及分子量分布。
分子是由組成的原子按照一定的鍵合順序和空間排列而結合在一起的整體，這種鍵合順序和空間排列關系稱為分子結構。由於分子內原子間的相互作用，分子的物理和化學性質不僅取決於組成原子的種類和數目，更取決於分子的結構。